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一.目的
用于化妆品微生物指标(菌落总数、霉菌和酵母总数、耐热大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)检测;
二.参照标准及微生物限量
本方案参照国家食品药品监督管理总局批准颁布的《化妆品安全技术规范》2015版和2022版征求意见稿、SN/T 2098-2008 《食品和化妆品中的菌落计数检测方法-螺旋平板法》。
三.组成部分
本方案提供化妆品微生物指标检测所需仪器和培养基及其他试剂。
四.检测流程及方案
流程解读
1.样品采集
2.样品前处理
2.1液体样品:用吸管手动吸取或用自动重量稀释仪自动称重稀释,均质器自动均质后制成1:10检样。按需进行梯度稀释。
2.2 油性液体样品:10g样品+5mL灭菌石蜡油混匀+10ML灭菌吐温80
(40℃-44℃水浴振荡10min)+75ML灭菌生理盐水(40℃-44℃预温),乳化后制成1:10的悬液。按需进行梯度稀释。
2.3 膏、霜、乳剂半固体状样品
2.3.1 亲水性样品:10g样品+ 90ML灭菌生理盐水,均质 1min—2min,静止取上清,上清为1:10匀液。按需进行梯度稀释。
2.3.2 疏水性样品: 10g样品+ 10mL 灭菌液体石蜡 + 10mL 灭菌吐温 80 + 70mL 灭菌生理盐水,均质 3min—5min,制成 1:10 检液。按需进行梯度稀释。
2.3.3 固体样品:称取 10g+90mL 灭菌生理盐水,均质 3min—5min,充分均质混匀,静置后,取上清液作为 1:10 的检液。
总结:化妆品根据与水分子的亲和性及性状的不同,具有不同的类型,包括疏水性样品和亲水性样品以及液体样本和固体样本,相关标准规定不同类型的样品取10g/10mL经过不同的前处理,最终形成1:10的检液。其中,亲水性样本一般选择生理盐水进行稀释,而油性液体样本或疏水性样本稀释液除生理盐水以外,还需添加一定体积的非离子型表面活性剂(如tuwen80)与液体石蜡混合用于样品的乳化过程,从而使微生物更均匀的分散,以便于其检出。此过程一般可通过重量稀释仪和均质器实现。
3. 样品接种
根据化妆品技术规范需要倾注法接种样品,但此法对操作人员的要求较高,而涂布法操作难度低,可预先倒置相关微生物检测的培养基平板,用自动细菌涂布仪涂布接种,上样量可调至100微升。此外,根据SN/T 2098-2008 《食品和化妆品中的菌落计数检测方法-螺旋平板法》,化妆品中菌落计数还可选择螺旋接种法。
4. 样品培养
细菌用恒温培养箱培养,霉菌和酵母菌用霉菌培养箱,培养条件根据微生物种类的不同而不同。
表2 不同微生物指标检测培养条件
微生物种类/ 检测指标 |
培养条件 |
|
温度 |
时间 |
|
菌落总数 |
36℃±1℃ |
48h±2h |
耐热大肠菌群 |
44.5℃±0.5℃/36℃±1℃ |
24h±2h/18h-24h |
铜绿假单胞菌 |
36℃±1℃ |
18h—24h |
金黄色葡萄球菌 |
36℃±1℃ |
24h±2h |
霉菌和酵母菌 |
28℃±2℃ |
5d |
5.样品检测
微生物定量检测用全自动菌落计数仪实现菌落计数,如样品中菌落总数的测定、霉菌及酵母菌总数;微生物定性检测用自动微生物生化鉴定系统实现,如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的定性。
五.产品信息
表3 化妆品微生物指标检测相关设备列表
序号 |
设备名称 |
推荐型号 |
推荐品牌 |
1 |
重量稀释仪 |
DW-JURAY |
杭州大微 |
2 |
拍击式均质器 |
DW-4 |
杭州大微 |
3 |
微生物试剂自动分装仪 |
DW-9 |
杭州大微 |
4 |
全自动微生物螺旋接种仪 |
DW-L2000 |
杭州大微 |
5 |
自动微生物涂布接种仪 |
DW-16 |
杭州大微 |
6 |
全自动革兰氏染色仪 |
DW-GS100 |
杭州大微 |
7 |
细菌麦氏浊度仪 |
DW-MF30 |
杭州大微 |
8 |
自动微生物生化鉴定系统 |
DW-M80 |
杭州大微 |
9 |
全自动微生物菌落计数仪 |
DW-V9 |
杭州大微 |
10 |
恒温培养箱 |
BPMJ-150F |
上海力康 |
11 |
霉菌培养箱 |
BPH-9162 |
上海力康 |
12 |
水浴振荡器 |
HTS-10 |
上海赫田 |
表4 化妆品微生物指标检测相关培养基
序号 |
检测指标 |
培养基名称 |
规格及货号 |
推荐品牌 |
1 |
细菌总数 |
TTC卵磷脂、吐温 80 —营养琼脂 |
250g/瓶, HB5189 |
青岛海博 |
2 |
耐热大肠菌群 |
双倍乳糖胆盐(含中和剂) |
250g/瓶, HB8593 |
青岛海博 |
3 |
伊红美兰(EMB)琼脂 |
250g/瓶, HB0107 |
青岛海博 |
|
4 |
胰蛋白胨水 |
250g/瓶, HB5218 |
青岛海博 |
|
5 |
铜绿假单胞菌 |
SCDLP 液体培养基 |
250g/瓶
|
广东环凯 |
6 |
十六烷基三甲基溴化铵培养基 |
9cm*10/包, HBPM5184 |
青岛海博 |
|
7 |
营养琼脂 |
250g/瓶, HB0109 |
青岛海博 |
|
8 |
金黄色葡萄球菌 |
SCDLP 液体培养基(见上)或 7.5%氯化钠肉汤 |
250g/瓶, HB4119 |
青岛海博 |
9 |
Baird Parker 平板 |
250g/瓶, HB4115 |
青岛海博 |
|
10 |
亚碲酸盐卵黄增菌液(Baird Parker 平板添加剂) |
5ml*10 ,HB4116-1 |
青岛海博 |
|
11 |
霉菌及酵母 |
孟加拉红琼脂培养基 |
250g/瓶,HB0237-2 |
青岛海博 |
表5 化妆品微生物指标检测相关试剂
序号 |
试剂名称 |
用途 |
规格及货号 |
推荐品牌 |
1 |
氯化钠 |
样品前处理稀释 |
500g/瓶 |
国药 |
2 |
吐温80 |
样品乳化剂 |
100ml/瓶,9005-65-6
|
biosharp |
3 |
无菌液体石蜡 |
样品前处理 |
1.7ml*20, GS070 |
青岛海博 |
4 |
Kovacs氏靛基质试剂盒 |
耐热大肠靛基质实验 |
5ml*2/盒;HB8279 |
青岛海博 |
5 |
革兰氏染色液 |
细菌染色 |
500Ml/瓶,3瓶/套 |
杭州大微 |