【厌氧培养技术指南】生孢梭菌培养方法及注意事项

指南目录：

1、生孢梭菌概况

2、培养方法

3、操作注意事项

 

生孢梭菌（Clostridium sporogenes）是一种严格厌氧的革兰氏阳性梭菌，细胞呈杆状，可形成卵圆形次端生芽孢，以周生鞭毛运动，能分解蛋白质和糖类并产生丁酸等代谢产物。

生孢梭菌是人和动物胃肠道正常微生物群的成员之一。同时作为中国及国外药典中常用的标准菌株，也被广泛用于培养基的灵敏度检查、适用性检查、无菌检查及控制菌检查等质量控制环节。在食品和化妆品微生物检验中，也常作为定量或定性的对照菌株使用。

生孢梭菌培养难点：

1、严格的厌氧环境：生孢梭菌是专性厌氧菌，接触氧气会抑制生长甚至导致死亡。

2、芽孢的活化与萌发：生孢梭菌在不利环境下会形成休眠的芽孢。芽孢对热、干燥和消毒剂有极强的抗性，需要特定条件才能诱导其萌发成营养态细胞。

3、冻干菌种可能因长期休眠而生长延迟，需要耐心培养。

生孢梭菌培养流程：

一、菌种复苏：

按菌种使用说明复苏

二、增菌与培养：

1、将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基

2、打开DW-100A-K Plus智能厌氧微生物培养系统

3、将处理好的平板放入系统配套厌氧罐内，插入厌氧培养专用催化剂，连接罐体与主机

4、选择“厌氧培养”操作程序

5、设备启动，气体置换程序自动运行，90秒后即可生成厌氧环境

6、将培养罐脱离主机，放入30～35℃的环境中培养24～48h

三、鉴定：

可通过生化方法或更为快速简便的[DW-MS 5500飞行质谱微生物快速鉴定系统]进行鉴定

实验操作注意事项：

1、生物安全防护：严格执行生物安全等级1（BSL-1） 的实验室操作规范。所有操作需在生物安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备。

2、菌株复苏与传代：开管前用75%酒精擦拭瓶壁消毒。加入约0.5ml液体培养基使冻干粉溶解，于35-37℃无氧条件下培养18-24小时（若未生长，可延至72小时）。注意传代次数不应超过5代，以防菌种特性改变。

3、短期与长期保存：

短期保存：生长良好的斜面或穿刺管可于4℃ 冰箱保存1-3个月。

长期保存：推荐采用添加了保护剂（如10%甘油）的-80℃超低温冷冻或液氮保存。

4、废弃物处理：所有接触过菌株的耗材及废弃物，使用后必须进行高压灭菌处理，并遵循实验室生物安全废弃物处理规程。